1. 選用原代細胞生長狀態(tài)好（90-95%），生長數(shù)量大于5×105進行傳代。
2. 吸除原代細胞培養(yǎng)液。用含雙抗的1×PBS（pH7.4）清洗細胞培養(yǎng)瓶2次。
3. 1ml細胞消化液加入細胞培養(yǎng)瓶，輕輕搖動，使細胞消化液覆細胞培養(yǎng)瓶底。
4. 細胞培養(yǎng)瓶置于5%CO2、95%空氣、37oC培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)數(shù)分鐘后，在顯微鏡下觀察原代細胞的消化狀態(tài)。
請記?。喝缳N壁細胞逐漸趨于圓形、部分懸浮后，用手指輕輕拍打細胞培養(yǎng)側部或底部至大部分貼壁細胞懸浮，加入細胞終止液，終止細胞消化。每種原代細胞的消化時間是有差異的。
5. 吹打培養(yǎng)瓶中懸浮細胞若干次，再吸出細胞懸浮液，轉入15ml離心管中，1000rpm離心5分鐘。
6. 棄離心管中液體，加入原代細胞培養(yǎng)液重懸細胞。細胞計數(shù)，確定細胞數(shù)量。
細胞分瓶后，加入適量原代細胞培養(yǎng)液至細胞培養(yǎng)瓶中，置于5%CO2、95%空氣、37oC培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24小時。
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